豬環磷酸鳥苷（cGMP）elisa試劑盒說明書

l 本試劑盒用於體外定量檢測血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中豬環磷酸鳥苷（cGMP）的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

l 本試劑盒僅供體外研究使用，不用於臨床診斷

實驗原理

試劑盒採(cǎi)用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被豬環磷酸鳥苷（cGMP）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入标本、标準品、HRP标記的檢測抗體，經過溫育並(bìng)*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並(bìng)在酸的作用下轉化成終的黃色。顔色的深淺和樣品中的豬環磷酸鳥苷（cGMP）呈正相關。用酶标儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：全血标本請於室溫放置2小時或4℃過夜後於1000g離心20分鍾，取上清即可檢測，或将标本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作爲抗凝劑，标本採集後30分鍾内於2 - 8°C 1000g離心20分鍾，或将标本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。

3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重後将組織剪碎。将剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要适當調整，並做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，於冰上充分研磨。爲瞭進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反複凍融。後将勻漿液於5000×g離心5~10分鍾，取上清檢測。

4.  細胞培養物上清或其它生物标本：1000g離心20分鍾，取上清即可檢測，或将标本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。
注：标本溶血會影響後檢測結果，因此溶血标本不宜進行此項檢測。

标本處理

1.  本公司隻對(duì)試劑盒本身負(fù)責，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

2.  實驗前應預測(cè)标本含量，如果标本濃度過高，應對(duì)标本進行稀釋，使稀釋後的标本符合試劑盒的檢測(cè)範圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。标本使用0.01mol/L的PBS稀釋(PH=7.0-7.2)。

3.  若所檢(jiǎn)樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，並(bìng)注意留存樣本。

4.  使用化學裂解液制備(bèi)的組織勻漿或細胞提取液可能會由於(yú)某些化學物質的引入導緻ELISA實驗結果偏差。

5.  若樣本爲細胞培養上清，因該類樣本幹擾因素較多，如：細胞狀态、細胞數量、採(cǎi)樣時間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。

6.  某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因爲與本産(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。

7.  建議使用新鮮樣本，保存時間過長(zhǎng)可能會存在蛋白降解或變(biàn)性導緻實驗結果偏差。

需要而未提供的試劑和器材

• 酶标儀（450nm）
• 高精度加樣器及槍(qiāng)頭(tóu)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
• 37℃恒溫箱
• 蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

備注：

1.  标準品濃(nóng)度依次爲(wèi)：32、16、8、4、2、0 nmol/L

2.  經過大量正常标本檢驗，标本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)範圍内，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過大标準品濃度時，可用樣本稀釋液将标本進行适當(dāng)稀釋後再進行實驗。

注意事項

• 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確(què)結果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用後立即冷藏保存試劑。
• 洗闆不正確(què)可以導(dǎo)緻不準確(què)的結果。在加入底物前確(què)保盡量吸幹孔内液體。溫育過程中不要讓微孔幹燥掉。
• 消除闆底殘(cán)留的液體(tǐ)和手指印，否則影響OD值。
• 底物顯色液應呈無色或很淺的顔色，已經(jīng)變(biàn)藍的底物液不能使用。
• 避免試劑(jì)和标本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結果。
• 在儲(chǔ)存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。
• 平衡至室溫後(hòu)再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷闆條上。
• 任何反應試劑不能接觸(chù)漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
• 不能使用過期産品。
• 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處(chù)理樣品和檢測(cè)裝置。

試劑準備

試劑盒從(cóng)冷藏環境中取出應在室溫平衡後(hòu)方可使用。

20×洗滌(dí)緩沖(chōng)液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌(dí)緩沖(chōng)液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.  從(cóng)室溫平衡20min後(hòu)的鋁箔袋中取出所需闆條，剩餘闆條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置标準品孔和樣本孔，标準品孔各加不同濃(nóng)度的标準品50μL；

3.  樣(yàng)本孔中加入待測(cè)樣(yàng)本50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，标準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）标記的檢測(cè)抗體100μL，用封闆膜封住反應孔，37℃水浴鍋(guō)或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌(dí)液（350μL），靜置1min，甩去洗滌(dí)液，吸水紙上拍幹，如此重複(fù)洗闆5次（也可用洗闆機洗闆）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min内，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

實驗結果計算

以所測(cè)标準品的OD值爲橫坐标，标準品的濃度值爲縱坐标，在坐标紙上或用相關軟件繪制标準曲線，並(bìng)得到直線回歸方程，将樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1.  檢測(cè)範(fàn)圍：1 nmol/L – 32 nmol/L。

2.  靈敏度：低檢測(cè)濃度小於(yú)0.1 nmol/L。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。

4.  重複性：闆内變(biàn)異系數小於(yú)10% ，闆間變(biàn)異系數小於(yú)15% 。

說明

1.  由於(yú)現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本産(chǎn)品可能存在一定的質量技術風險。

2.  終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當(dāng)時的實驗環境密切相關，請務必準備(bèi)充足的标本備(bèi)份。

3.  不同批次的同一産品可能會有少許差别，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時間等，請依據試劑盒内說明書進行實驗操作，網上電子版說明書僅作參(cān)考。

4.  隻有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他商的産(chǎn)品。隻有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到*的檢測(cè)結果。

問題解答

若實驗效果不好，請及時對顯色結果拍照，保留所用闆條及未使用試劑，並(bìng)妥善保存，然後聯xi我公司技術人員爲您解決問題。同時您也可以參(cān)考以下資料：