豬胰蛋白酶制備及注意事項

上海恒遠生物提供豬胰蛋白酶制備方法，歡迎閱讀參考

（一）豬胰蛋白酶原的提取

• 豬胰髒1.0Kg（新鮮的或殺後(hòu)立即冷藏的），除去脂肪和結締(dì)組織後(hòu)，絞碎。
• 加入2倍體積預冷的乙酸酸化水（pH2.5）於(yú)10～15℃攪拌提取24小時，四層(céng)紗

布過濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，放置3～4小時後用折疊(dié)濾紙過濾得黃色透明濾液（約1.5升）。

• 加入固體硫酸铵（予先研細），使溶液達(dá)0.75飽(bǎo)和度（每升濾液加492克）放置過

夜後抽濾（擠壓幹），得豬胰蛋白酶原粗制品。（二）胰蛋白酶原激活

• 向胰蛋白酶原粗制品濾餅(bǐng)分次加入10倍體積(jī)（按餅(bǐng)重計）冷的蒸餾水，使濾餅(bǐng)溶

解，得胰蛋白酶原溶液。将研細的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中（濾餅(bǐng)中硫酸铵的含量按餅(bǐng)重的四分之一計），使 Ca2+與SO42-結合後，邊(biān)加邊(biān)攪拌均勻，邊(biān)加邊(biān)攪拌，使溶液中zui終仍含有0.1M CaCl2。

2．用5M NaOH調pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg）輕輕攪拌，於(yú)室溫下活化8～10小時，（2～3小時取樣一次，並(bìng)用0.001M HCl稀釋），測定酶活性增加的情況。

3．活化完成（比活約3500～4000BAEE單(dān)位）後，用2.5M H2SO4調pH至2.5～3.0，抽濾除去CaSO4沉澱(diàn)。

（三）胰蛋白酶的分離

1．将已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入細粉狀固體硫酸铵，使溶液達到0.4飽(bǎo)和度，放置數小時後，抽濾，棄去濾餅(bǐng)。

2．濾液按250克/升加入研細的硫酸铵，使溶液飽(bǎo)度達(dá)到0.75，放置數小時，抽濾，棄去濾液。

（四）胰蛋白酶的結晶

1．将上述胰蛋白酶濾餅(bǐng)（粗胰蛋白酶）溶解後進行結晶：按每克濾餅(bǐng)溶於(yú)1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計加入緩沖液，小心攪拌溶解。

2．用2M NaOH調pH至8.0，注意要小心調節，偏酸不易結晶，偏堿易失活，存放於(yú)冰箱。3．放置數小時後，應出現大量絮狀物，溶液逐漸變(biàn)稠呈膠态，再加入總體積的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠态分散，必要時加入少許胰蛋白酶晶體。

4．放置2～5天可得到大量胰蛋白酶結(jié)晶，待結(jié)晶析出*時，抽濾(lǜ)，母液回收。

（五）胰蛋白酶的重結晶

将*次結晶的胰蛋白酶産(chǎn)物進行重結晶：用約1倍的0.025M HCl，使上述結晶分散，加入約1.0～1.5倍體積的pH9.0 的0.8M硼酸緩沖液，至結晶酶全部溶解，取樣後，用2M NaOH調溶液pH至8.0（準確(què)）（體積過大，很難結晶），冰箱放置1～2天，可将大量結晶抽濾得第二次結晶産(chǎn)物(母液回收)，冰凍幹燥後得重結晶的豬胰蛋白酶。

注意事項

（1）胰髒必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導(dǎo)緻實驗失敗(bài)。

（2）在室溫14～20℃條件下8～12小時可激活*，激活時間過長(zhǎng)，因酶本身自溶而會使比活降低，比活性達(dá)到 “3000～4000BAEE單位/mg蛋白”時即可停止激活。

（3）要想獲得胰蛋白酶結晶，在進行結晶時應十分細心地按規定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純(chún)化效果愈好，則培養結晶也較容易，因此每一步操作都要嚴格。酶蛋白溶液過稀難形成結晶，過濃則易形成無定形沉澱析出，因此，必需恰到好處(chù)，一般來說待結晶的溶液開始時應略呈微渾濁狀态。

（4）過(guò)酸或過(guò)堿都會影響結晶的形成及酶活力變(biàn)化，必須嚴格控制PH。

（5）*次結晶時，3～5天後(hòu)仍然無結晶，應檢查pH，必要時調(diào)整pH或接種，促使結晶形成。重結晶時間要短些。