人晚期糖基化終末産物試劑盒的操作方法

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測(cè)定标本中人晚期糖基化終末産物 （AGEs）水平。用純化的人晚期糖基化終末産物 （AGEs）抗體包被微孔闆，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入晚期糖基化終末産物 （AGEs），再與HRP标記的晚期糖基化終末産物 （AGEs）抗體結合，形成抗體-抗原-酶标抗體複合物，經過*洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並(bìng)在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顔色的深淺和樣品中的晚期糖基化終末産物 （AGEs）呈正相關。用酶标儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），通過标準曲線計算樣品中人晚期糖基化終末産物 （AGEs）濃度。

試劑盒組成

1	30倍濃縮洗滌液	20ml×1瓶	7	終止液	6ml×1瓶
2	酶标試劑	6ml×1瓶	8	标準(zhǔn)品（960pg/ml）	0.5ml×1瓶
3	酶标包被闆	12孔×8條	9	标準品稀釋液	1.5ml×1瓶
4	樣品稀釋液	6ml×1瓶	10	說明書	1份
5	顯色劑A液	6ml×1瓶	11	封闆膜	2張
6	顯色劑B液	6ml×1/瓶	12	密封袋	1個

操作方法：

1.         标準品的稀釋：本試劑盒提供原倍标準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

480pg/ml	5号标準品	150μl的原倍标準(zhǔn)品加入150μl标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
240pg/ml	4号标準品	150μl的5号标準(zhǔn)品加入150μl标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
120pg/ml	3号标準品	150μl的4号标準(zhǔn)品加入150μl标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
60pg/ml	2号标準品	150μl的3号标準(zhǔn)品加入150μl标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
30pg/ml	1号标準品	150μl的2号标準(zhǔn)品加入150μl标準(zhǔn)品稀釋(shì)液

2.         加樣：分别設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶标試劑，其餘各步操作相同）、标準孔、待測樣品孔。在酶标包被闆上标準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度爲5倍）。加樣将樣品加於酶标闆孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.         溫育：用封闆膜封闆後置37℃溫(wēn)育30分鍾(zhōng)。  

4.         配液：将30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用

5.         洗滌：小心揭掉封闆膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。

6.         加酶：每孔加入酶标試劑50μl，空白孔除外。

7.         溫育：用封闆膜封闆後置37℃溫(wēn)育30分鍾(zhōng)。  

8.         洗滌：小心揭掉封闆膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鍾.

10.     終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11.     測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以内進行。