實驗原理：
流式細胞術(flow cytometry，FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。它可以高速分析上萬個細胞，並(bìng)能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成爲當代先進的細胞定量分析技術。FCM所有這些功能的實現依賴於一種特殊的儀器——流式細胞儀，它是綜合瞭(le)激光、電腦、流體力學、光學和熒光細胞學等先進技術的高科技産品。流式細胞主要是測量單個細胞經适當染色後所發出的散射光和熒光，經染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點，當每個細胞經過焦點時，發出一束散射光／熒光。它們經過過濾及光鏡系統收集到一個光電檢測器(光電倍增管或一個固态裝置)，光檢測器把散射光定量轉化成電信号，經數字轉換器進行數字化後進行電子存儲，以後數據可以調出顯示和進行分析。流式細胞術不僅可測量細胞的大小、内部顆粒的性狀，還可檢測細胞表面和胞漿抗原、細胞内DNA、RNA含量等，在細胞生物學、血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。
材料與儀器：
培養的細胞 外周血單(dān)個(gè)核細胞
小牛血清 無(wú)水乙醇 RNase A PBS PI Heochst 33342染液。
流式細胞儀 玻璃管、塑料管 離心機(jī) 熒光顯微鏡(jìng) 400目的篩網
操作步驟：
一、單細胞懸液制備方法
流式細胞術的分析檢測(cè)建立在單個細胞的基礎上，制備(bèi)合格的單個分散的細胞懸液是非常關鍵的一環。對不同來源和不同形式的樣品，根據各種樣品的特點可選擇不同的分散方法。
1. 單層培養細胞、血液、各種脫落細胞等樣品，标本經過簡單的制備(bèi)懸液，離心分離處理，就可以得到分散較好的單個細胞懸液，是理想的流式細胞術檢測(cè)對象。
2. 對於(yú)不同組織來源的實體組織标本，採(cǎi)用酶消化法、機械法和化學試劑處理法來分散細胞。
3. 石蠟包埋組織單細胞懸液的制備(bèi)，可使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，從而擴大瞭(le)流式細胞術的應用範圍。樣品制備(bèi)一般通過切片、脫脂、水化、消化及終止消化後過濾再收集細胞懸液，去除碎片的單細胞懸液用70％乙醇固定保存。
二、檢(jiǎn)測(cè)細胞周期各時相的細胞百分數
1. 培養或分離的細胞約爲1×106，離心沉澱(diàn)後(hòu)用0.3ml含10％小牛血清的PBS懸浮，移入1.5ml EP管中，加入0.7ml無水乙醇，置-20℃下固定24h以上。
2. 3000 r/min離(lí)心30s，棄上清液，用lml PBS重懸細胞，再離(lí)心洗滌(dí)細胞一次。
3. 棄(qì)上清液，沉澱(diàn)細胞用100μl 1mg/ml RNase A懸浮，37℃下放置30min。
4. 加入400μl 50μg/ml PI，置暗處(chù)10min。
5. 最後(hòu)用流式細胞儀測(cè)定。
根據流式報(bào)告中給(gěi)出G0/G1、S、G2/M各期細胞的百分比、凋亡百分比和細胞倍體進行實驗分析。
三、流式細胞儀檢(jiǎn)測(cè)細胞凋亡（Heochst 33342/PI雙染色法）
1. 懸浮生長(zhǎng)的細胞在培養的狀态下加入Heochst 33342，終濃(nóng)度爲l μg/ml；37℃培養箱孵育7——10min。
2. 500——1000 r/min低溫離(lí)心5min，棄(qì)去染液。
3. 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4. 400目的篩網過(guò)濾(lǜ)1次。
5. 流式細胞儀檢(jiǎn)測(cè)分析。
四、結果觀察
1. 根據流式報(bào)告中給(gěi)出的G0/G1、S、G2/M各期細胞的百分比、凋亡細胞百分比和細胞倍體進行實驗分析。
2. 細胞凋亡觀察
Heochst 33342用氪激光激發的紫外線熒光，激發光波波長爲352nm，發射光波波長爲400——500nm，産(chǎn)生藍色熒光；PI用氩離子激光激發熒光，激發光波長爲488nm，發射光波長大於(yú)630nm，産(chǎn)生紅色熒光。分析藍色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
3. 結果判斷
在藍色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，正常細胞爲低藍光/低紅光，凋亡細胞爲高藍光/低紅光，壞死細胞爲低藍光。
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