技術專欄:關於流式細胞術（FCM）

    FCM是利用流式細胞儀對處在快速直線流動狀态中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數、快速的定性、定量分析或分析技術。然而，在FCM的實際應用過程中，要想得到高質量的流式數據卻並(bìng)非易事。現就FCM實驗中的常見問題進行分析，希望能幫(bāng)助相關實驗人員提高實驗成功率。



    一、怎麽(me)選擇合适的對(duì)照？


    1）同型對(duì)照：使用同型抗體做平行實驗，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合。


    2）陰性細胞對(duì)照：使用已知的不表達(dá)目标抗原的細胞做平行實驗，主要目的是消除抗體的非特異性結合。


    3）二抗對照：第二抗體多爲熒光标記的多抗，非特異性結合一般較高，可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高，設立二抗對照平行實驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著(zhe)色。


    4）陽性對(duì)照：一般會使用已知的高表達(dá)目标抗原的細胞做平行實驗，主要目的是排除實驗中實驗方法、試劑、操作等實驗的影響因素。


    5）空白對照：不進行任何标記的細胞，主要目的是用於(yú)測(cè)定基礎熒光信号表達值。


    二、收集的細胞通過(guò)流式儀檢測(cè)時，一般多少的細胞量合适？


    進行流式檢測(cè)時，至少需要記錄5000個活細胞，一般調(diào)整細胞密度至1*106/100ul進行流式檢測(cè)。


    三、FCM檢測(cè)過(guò)程中如何設門（gating）？


    一般根據散射光進行設門，即我們通常所說的前散（forward scatter, FSC）和側(cè)散（side scatter, SSC）來設門。FSC的大小與細胞的直徑成正相關，不同的細胞，細胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小與細胞内顆粒結構的質量成正相關，不同的細胞，細胞内顆粒結構越複(fù)雜，質量越大，其SSC越大；反之越小。


    四、FCM檢測(cè)過程中如何調節補(bǔ)償？


    在FCM檢測過程中，如果存在多色，則必須進行熒光補(bǔ)償調節。調節補(bǔ)償首先要知道雙陰性細胞的情況，其次，必須要用單陽和雙陰性細胞。隻有在有陰性細胞作爲參(cān)照的情況下，才能既不會過多又不會過少地調節補(bǔ)償。


    五、FCM檢(jiǎn)測(cè)時，每次實驗的細胞數一定要相同嗎？


    FCM檢測時，若不進行細胞計數而憑感覺随意進行實驗會直接影響實驗結果。當細胞量多而抗體量不變(biàn)或細胞量不變(biàn)而抗體量減少，那麽熒光抗體平均分布到每個陽性細胞上的量就會相對減少。由此可見，不同的細胞量會影響最終的實驗結果。因此，在準備(bèi)樣本時，必須進行細胞計數，使每個分組及每次實驗的細胞數保持一緻。