ELISA 即酶聯免疫吸附測(cè)定，是一類常用的免疫酶技術。主要方法是将已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，然後利用酶标記（偶聯）的抗體或抗原與之孵育，加入顯色劑顯色，通過(guò)酶标儀測(cè)定待測(cè)物顔色與标準物顔色的差異，繪制出酶活曲線得出待測(cè)物濃度。
一、四種(zhǒng)常見(jiàn)ELISA方法:
1.直接ELISA
将抗原固定於(yú)ELISA闆上，然後用酶标抗體直檢測抗原。相較於(yú)其它類型的ELISA實驗，直接ELISA實驗步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免瞭(le)交叉反應，測定結果不容易出錯。但是由於(yú)直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質蛋白都會與ELISA闆結合，實驗背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結合的一抗，實驗不太靈活。另外由於(yú)沒有使用二抗，信号沒有被放大，降低瞭(le)測定的靈敏度。
2.間接ELISA
先将抗原結合到ELISA闆上，随後分兩步進行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結合，随後加入酶标二抗檢測並(bìng)利用底物顯色。與直接ELISA相比，間接ELISA用到酶标二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的标記抗體，更經濟。間接ELISA還提供瞭(le)更大的靈活性，因爲不同的一抗能夠與單一标記的二抗一同使用。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應的可能性（酶标二抗直接與抗原結合），可能會增加背景，同時與直接ELISA相比，間接ELISA實驗多瞭(le)二抗孵育的步驟，實驗周期延長。
3.夾心ELISA
先将捕獲抗體固定於ELISA闆孔中，然後加入樣品，接著(zhe)加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶标抗體，則可稱爲直接夾心ELISA；如果檢測抗體不帶有标記，則還需要使用酶标二抗與檢測抗體結合，這種稱爲間接夾心ELISA。夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍；同時夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結合，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進行檢測，靈活性較高。夾心ELISA的缺點是對配對抗體要求很高，如果沒有标準化的試劑盒或者已經通過測試的配對抗體，則需要進行配對抗體定制並(bìng)進行優化，因爲降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應是非常重要的。
4.競争ELISA法
預先将抗原包被在固相載體上，並(bìng)加入酶标記的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預先包被在固相載體上的抗原競争結合酶标抗體；如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統中原有的酶标抗體競争結合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競争結合的酶标抗體，後加底物顯色。需要注意的是顯色結果與待檢抗原（或抗體）的量成反比。競争ELISA相對以上介紹的三種方法更複雜一些，但以上三種ELISA類型都适用於(yú)競争ELISA的形式。其主要優點在於(yú)可檢測不純的樣品，且數據再現性高，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。
二、ELISA常見(jiàn)問題與解決(jué)方法
1. 陰性對(duì)照出現陽性結(jié)果
① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當(dāng)導(dǎo)緻相鄰孔之間溶液濺灑出現交叉污染——更換試劑，小心操作。
② 酶标闆洗滌(dí)不chedi——洗闆前先将抗體溶液倒幹淨，然後清洗液倒滿闆孔，確(què)保能充分洗滌(dí)。
③ 抗體量過多導(dǎo)緻非特異性結合——根據說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到适當(dāng)濃度。
2．酶标闆整體背景高
① 抗體非特異性結合——應確保闆孔進行瞭(le)封閉並(bìng)且使用的是恰當的封閉液以防止非特異性結合。
② 底物結合濃度過高——對(duì)底物進行适當(dāng)稀釋。
③ 反應時間過長(zhǎng)——當(dāng)酶标闆顯色足夠進行吸光度讀數時立即使用終止液終止反應，适當(dāng)縮短顯色時間。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應是澄清透明的，若出現黃(huáng)色或其他顔色表明受到污染，應更換(huàn)新的底物溶液。
⑤ 底物孵育過(guò)程沒有避光——底物孵育應在避光條件下進(jìn)行。
3. 複孔之間重複性差
① 樣品數量不整齊，加樣時間有長(zhǎng)有短——加重複(fù)孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。
② 加樣量不一緻——樣品稀釋前應充分混勻，並(bìng)且使用同一移液槍(qiāng)。
③ 洗滌(dí)條件、操作人員不一緻——重複測(cè)定樣品時，操作條件、人員應盡可能與上次保持一緻。
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