開學瞭(le)，過瞭(le)一個寒假，ELISA實驗操作還記得吧，今天恒遠生物就帶(dài)大家一起來回顧下ELISA實驗的疑難點！
實驗原理
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶标記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶标記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時，受檢标本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與液體中的其他物質分開。再加入酶标記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與标本中受檢
物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化成爲有色産物，産物的量與标本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於(yú)酶的催化效率很高，間接地放大瞭(le)免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。
實驗流程
夾心法ELISA：
1.加樣：将标準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液並(bìng)列加兩孔，每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL(若樣本濃度高於(yú)檢測範圍，需用标準品&樣本稀釋液稀釋後取樣)。給酶标闆覆膜，37℃孵育90分鍾。提示：加樣時将樣品加於(yú)酶标闆底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免産生氣泡。加樣時間宜控制在10分鍾内。
2.生物素化抗體/抗原：棄去液體，甩幹(gàn)，不用洗滌(dí)。每個孔中立即加入生物素化抗體/抗原工作液100 μL，混勻，酶标闆加上覆膜，37℃孵育1小時。
3.洗滌(dí)：甩盡孔内液體，每孔加洗滌(dí)液350 μL，浸泡1-2分鍾，吸去或甩掉酶标闆内的液體，在厚的吸水紙上拍幹。重複此洗闆步驟3次。提示：此處(chù)與其他洗闆步驟都可用洗闆機。每一步洗滌(dí)充分是實驗的根本。
4.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻(yún)，加上覆膜，37℃孵育30分鍾。
5.洗滌(dí)：棄(qì)去孔内液體，洗闆5次，方法同步驟3。
6.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鍾左右。提示：根據實際顯色問題酌情縮短或延長孵育時間，但不可超過30分鍾。當标準孔出現明顯梯度時，即可終止。
7.終止：每孔加終止液50 μL，終止反應。提示：終止液的加入順(shùn)序應盡(jǐn)量與底物溶液的加入順(shùn)序相同。
8.讀值：立即用酶标儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶标儀預熱，設置好檢測(cè)程序。
9.實驗完畢(bì)後，将未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質期。
競(jìng)争法ELISA：
1.加樣：将标準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液並(bìng)列加兩孔，每孔50 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔50 μL(若樣本濃度高於(yú)檢測範圍，需用标準品&樣本稀釋液稀釋後取樣)。立即每孔加入配好的
生物素化抗體工作液50 μL。混勻，給酶标闆覆膜，37℃孵育45分鍾。提示：加樣時将樣品加於(yú)酶标闆底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免産(chǎn)生氣泡。加樣時間宜控制在10分鍾内。
2.洗滌(dí)：甩盡孔内液體，每孔加洗滌(dí)液350 μL，浸泡1-2分鍾，吸去或甩掉酶标闆内的液體，在厚的吸水紙上拍幹。重複此洗闆步驟3次。提示：此處(chù)與其他洗闆步驟都可用洗闆機。每一步洗滌(dí)充分是實驗的根本。
3.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻(yún)，加上覆膜，37℃孵育30分鍾。
4.洗滌(dí)：棄(qì)去孔内液體，洗闆5次，方法同步驟2。
5.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鍾左右。提示：根據(jù)實際(jì)顯色酌情縮短或延長孵育時間，但不可超過30分鍾。當标準孔出現明顯梯度時，即可終止。
6.終止：每孔加終止液50 μL，終止反應。提示：終止液的加入順(shùn)序應盡(jǐn)量與底物溶液的加入順(shùn)序相同。
7.讀值：立即用酶标儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶标儀預熱，設置好檢測(cè)程序。
8.實驗完畢(bì)後，将未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質期。
恒遠生物十幾年來一直緻力於生物科研領域，提供全面的、創新的、優質的、便捷的科研産品和服務。目前，其自主研發的重組蛋白、抗體、ELISA檢測試劑盒得到廣大科研用戶的認可，並(bìng)且多次發表於期刊，進一步推動瞭(le)民族品牌化的傳播。
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