細胞對一個實驗來說至關重要，細胞培養失敗，等於(yú)整個實驗都白費瞭(le)，那麽如果珍貴的細胞被污染瞭(le)，我們有什麽解救辦法嗎？恒遠小編爲您帶來瞭(le)這份幹貨，您瞧好瞭(le)！
一、抗生素法：
細菌培養：用無抗生素*培養液培養細胞3 d，收集上清離心後将沉澱物接種於血瓊脂培養基， 35e培養。
所採(cǎi)用的抗生素包括臨床常用的15種抗生素，抗生素zui适抑菌濃度篩選：根據細菌藥敏實驗結果選出敏感抗生素，每種抗生素從(cóng)zui低抑菌濃度MIC到zui高耐藥濃度分别配制6個濃度梯度。将LSC-1細胞按1*104/孔種96孔闆，細胞貼壁後加入含敏感抗生素的*培養液，24 h後換無抗生素培養液培養1 d，如此重複3次，連續7 d。
二、抗生素聯合巨噬細胞吞噬法：
将上述抗生素處理過的細胞再用小鼠的巨噬細胞處理。巨噬細胞的制備：将滅菌的玻璃粉與0. 9%氯化鈉注射液混和注入小鼠腹腔， 3 d後脫頸處死動物，無菌操作取小鼠腹腔液，離心收集巨噬細胞，與LSC-1細胞混合培養， 3 d後換液，棄去巨噬細胞。間隔一周後再用巨噬細胞共培養一次。
三、裸鼠體内接種法：
将LSC-1細胞按1*106個/mL接種裸鼠腋下皮下，連續觀察，當腫物長至約1cm3後，脫頸處死動物，無菌操作取出腫物，採取組織塊法做組織細胞培養。
免疫組織化學鑒定：
将上述3種方法處理的LSC-1細胞種植在直徑爲15 mm的無菌圓形蓋玻片上，貼壁後做角蛋白AE1 /AE3免疫組化染色、HE染色
細胞周期鑒定：
採用流式細胞儀測量碘化丙啶标記細胞的熒光強度，分析DNA含量。測試3種方法處理的LSC-1細胞周期，並與該細胞建系初期的第3代細胞狀況做比對。
抗生素撤離觀察：
用無抗生素的*培養基培養3種方法處理的細胞，連續觀察3周，取細胞上清做細菌培養。
細胞系的維持、凍存與複蘇：
将無抗生素培養3周的細胞按常規方法凍存，並於1個月後複蘇，觀察細胞生長狀态。
自建人喉癌細胞系LSC-1傳至第12代以後，細胞生長速度變(biàn)慢，已貼壁細胞變(biàn)圓、漂起、死亡，細胞間隙出現可運動的微小生物，但培養液依然清亮不渾濁，收取上清液離心，将沉澱物行常規血瓊脂培養， 24 h結果爲無菌生長，培養5~7 d後開始出現灰白色細小菌落，光滑濕潤，有透明溶血環，全自動細菌鑒定儀生化鑒定條檢測(cè)爲嗜麥芽寡養食單胞菌，該菌爲非發酵革蘭陰性杆菌。細菌藥敏結果：在15種抗生素中，該菌僅對頭孢他啶、哌啦西林、頭孢哌酮/舒巴坦3種藥物敏感，其餘均耐藥。
2.1 抗生素法除菌效果
經篩選， LSC-1細胞可耐受的抗生素*抑菌濃度分别爲：哌啦西林64 mg /L、頭孢他啶2 mg /L、頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L。LSC-1細胞在哌啦西林和頭孢他啶*抑菌濃度中分别傳代一次，在頭孢哌酮/舒巴坦中傳代3次，並每種細胞各凍存3株。複蘇情況：哌啦西林3株均未貼壁，頭孢他啶兩株複蘇後貼壁，但生長一周後均出現細菌，細胞死亡;另一株第二次凍存，再次複蘇後生長良好，但抗生素撤離後出現細菌，經鑒定仍爲嗜麥芽寡養食單胞菌。頭孢哌酮/舒巴坦3株複蘇後均能存活，但生長緩慢，一周傳代一次，仍有少量細菌，抗生素撤離後重又出現細菌污染。在3種抗生素中，頭孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和細胞生長狀态，頭孢他啶對細胞損傷較大，細胞表面粗糙，狀态較差。
2.2 抗生素聯合巨噬細胞吞噬法除菌效果
比較頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細胞先後使用和二者交替使用的除菌效果，並觀察細胞凍存複蘇後的傳代次數，具體方法爲：頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L培養1次、2次、4次後，再分别與巨噬細胞共培養2次，各凍存1株;頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細胞交替培養3次，凍存1株。複蘇後細胞狀态：頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細胞依次使用者中，抗生素使用次數較多的細胞傳代次數較多(5代);二者交替使用的細胞狀态更好於前3株細胞，且傳代次數也zui多(6代)。然而所有細胞zui終因狀态不佳或污染重現而死亡。
裸鼠體内接種法除菌效果
腫瘤細胞接種裸鼠體内40 d後開始出現腫塊， 60d長至1 cm3左右。處死動物取出腫物，瘤體質量0. 39 g，體積爲0. 8 cm*0. 6 cm*0. 4 cm。将組織塊培養於含三抗的*培養基， 14 d後改用無抗生素培養，持續培養3周，細胞生長良好。之後自然傳代8次，凍存1個月後複蘇，細胞仍能貼壁生長。取上清液做細菌培養，結果爲無菌生長。
2.4 細胞形态及生物學特性
抗生素處理及裸鼠接種後的LSC-1細胞形态與LSC-1第三代基本相同，細胞呈多邊形，有鋪路石感。
免疫組織化學細胞角蛋白染色，裸鼠接種後的和抗生素處(chù)理的細胞均有AE1 /AE3陽性表達(dá)，但前者陽性比例(圖1H)與第三代細胞(圖1G)接近，後者陽性表達(dá)較少。
HE染色，接種裸鼠的LSC-1細胞具有高度的異型性：細胞形态及大小不等;核呈多形性：大小、形态及染色各異，胞核與胞質比例增大(接近1B1)，核仁粗大，數目增多，核分裂象增多，出現不對(duì)稱(chēng)、多極性等病理性核分裂，偶見巨核細胞，胞質有糖原顆粒，與LSC-1第三代細胞形态相一緻。
2.5 細胞倍體狀況及細胞增殖周期分析結果
用頭孢哌酮/舒巴坦處理3次後， LSC-1細胞周期直方圖雖爲近二倍體圖像，但S期、G2M期細胞峰較高，仍具有癌細胞的特點。裸鼠接種的LSC-1細胞呈現非整倍體圖像，且二倍體和異倍體的S期、G2M期峰均較高，更接近第3代LSC-1細胞周期DNA含量分布。3種細胞各核型比例：裸鼠接種細胞仍保持二倍體和異倍體核型，分别占44. 92%和55. 08%，與第3代細胞(二倍體41. 52%、異倍體58. 48% )基本相同，而頭孢哌酮/舒巴坦處理的細胞全部爲二倍體，異倍體細胞消失。
挽救污染細胞的方法有抗生素除菌法、巨噬細胞吞噬法和動物接種除菌法，其中較常使用的是抗生素沖擊法。清除效果的檢驗應包括無菌檢驗和細胞性狀評估。無菌檢驗指細胞在無抗生素培養基中傳代3~4次，顯微鏡下觀察無細菌、培養上清細菌無菌生長，方可確(què)定污染細菌被消除幹淨。細胞的組織來源鑒定和染色體分析是細胞系鑒定的兩個主要方面。LSC-1爲喉鱗狀上皮來源細胞系，參(cān)照相關文獻，我們選用角蛋白免疫組織化學鑒定和細胞周期DNA倍體分析方法評估細胞性狀。
細胞系中麥芽窄食單胞菌有可能來源於标本本身。由於該菌對氨基糖甙類和很多B-内酰胺類(包括碳青黴烯類)天然耐藥，故常規培養液中的青、鏈黴素不能*抑制其生長。有研究顯示，該菌僅對少數幾種抗生素如頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶等耐藥性較低，本文得到瞭(le)相同的結果。本實驗採用15種抗生素對該菌的抑菌效果進行測定，找出其中有效的3種，又分别對這3種抗生素的6個梯度濃度測試，zui後確定抗菌效果、細胞毒性zui小濃度爲32 mg /L頭孢哌酮/舒巴坦，其作用能控制細菌生長並(bìng)使細胞傳代2~3代，當聯合使用小鼠巨噬細胞後又使細胞傳代次數增加到5~6代。然而，抗生素的作用主要是通過抑制細菌細胞壁的合成達到抑制細菌生長的效果，並(bìng)不能直接殺死細菌。有研究表明，單獨使用抗生素處理細菌污染的KB口腔上皮樣癌細胞系，不能*清除細胞内的細菌。巨噬細胞在體外沒有其他免疫細胞和抗體等因素的參與下，其吞噬功能是有限的，在這裏僅起到輔助抗生素的作用， (相關的報道有用於挽救支原體污染的細胞，但體外抗細菌的作用尚未見報道)，故當抗生素撤離後以上2種方法處理的細胞中細菌再次出現。
另外，抗生素對培養細胞的形态和性狀都有一定的影響。本實驗有效的3種抗生素中，頭孢他啶毒性zui大，頭孢哌酮/舒巴坦雖然毒性相對弱一些，但也使喉癌細胞角蛋白AE1 /AE3表達有所減少、DNA倍體分析原有的異倍體細胞消失，接種裸鼠後不能成瘤。因此可以認爲，有針對性地使用抗生素或許可以短期控制住細胞系中污染細菌生長，但同時可能伴随有細胞生物學特性變(biàn)化。進而推論，抗生素沖擊法也難控制細菌再次暴發性生長，而且對細胞更有損傷。至於(yú)那些不做污染菌的分離和鑒定、僅靠單一某種廣譜抗生素來對付所有污染細菌，或是僅參照臨床用藥劑量來設計抗生素濃度等做法更不可取。
動物體内接種除菌法是利用動物的免疫系統來消滅污染微生物的方法。常用的動物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，其T細胞缺如緻使特異性細胞免疫功能喪失，但B細胞功能依然正常以及非特異性細胞免疫系統NK細胞活力強，故可用於(yú)腫瘤細胞的污染清除。細菌在裸鼠體内可被巨噬細胞和中性粒細胞吞噬、NK細胞殺滅、IgM、IgG類抗體結合病菌後激活補體殺死或溶解等。本實驗結果顯示，接種BALB /c-nu裸鼠之後的LSC-1細胞形态良好、生長旺盛，細胞間沒有細小微生物，傳代多達8次後，細胞凍存和複蘇仍能正常生長，並(bìng)在抗生素撤離後細胞生長狀态不變，細菌培養爲陰性。
細胞生物學特性上，細胞角蛋白陽性表達(dá)比例較高，與第3代LSC-1接近，保持瞭(le)原有上皮來源的性質，組織病理學觀察仍具有高度的異型性及腫瘤細胞的特征，細胞倍體及增殖周期分析結果顯示異倍體細胞及S期細胞的比例與第3代細胞相同。實驗表明，利用裸鼠去除腫瘤細胞系中的污染細菌是zui爲理想的方法，既能*清除污染細菌，又能保持腫瘤細胞的來源特征和惡性特性。
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